层流净化手术室不仅要求高度洁净的空气（进入手术室的空气首先须经高效过滤器净化），而且要求能控制气流的流通方向（即采用层流超净装置），手术室内形成正压环境，使气流从洁净度高的手术区域流向洁净度低的区域，一股细小、薄层的气流，以均匀的流速向同一方向输送，并带走和排出气流中的尘埃颗粒（尘粒）和细菌。目前，层流净化手术室分为垂直层流式和水平层流式两种。垂直层流式（Supply air ceiling for operating theatre）高效过滤器装在手术病床的正上方，气流垂直吹送，回风口设在墙面的四角，确保手术台洁净度达标，一般多采用垂直层流式效果较好。南京华世佳宝妇产医院正是采用的这种垂直的层流式，在手术室内的顶部还设置了一个吊塔式的负压吸引系统，将医生在手术时呼出的空气吸出塔外，进一步保证手术室的洁净和无菌，降低手术的感染率。
单通道流向
医院在层流净化手术室与消毒柜之间制作了一堵墙，并设立进、出单通道，需消毒的物品经过“输出”通道直接从手术室转移到消毒柜，消毒后经过“输入”通道转移到手术室，这样避免了消毒物品在转移的过程中二次污染。

层流净化手术室的空气压力根据其不同区域（如手术间、无菌准备间、刷手间、麻醉间和周围干净区域等）洁净度不同要求而不同。不同级别的层流净化手术室其空气洁净度标准不同，例如美国联邦标准1000级为每立方尺空气中≥0.5μm的尘粒数，≤1000颗或每升空气中≤35颗。10000级层流净化手术室的标准为每立方尺空气中≥0.5μm的尘粒数，≤10000颗或每升空气中≤350颗。依次类推。