1.纯化水质量标准

1.1 概述：本品为蒸馏法、离子交换法、反渗透法或其他适宜的方法制得供药用的水，不含任何附加剂。

1.2 纯化水的企业质量标准如下：

检验规程

2.1 微生物监测：在生产和贮存过程中，应采取适当的措施来确保有效控制或监测水中的微生物总数。设置适当的警戒限与行动限可用于发现不利的趋势。正常条件下，可用标称值不大于0.45 μm的微孔滤膜过滤，然后使用R2A琼脂在30-35℃培养至少5天后，计数微生物总数，其合适的行动限是100CFU/ml。检测所用样品量的选择与期望结果有关。

R2A培养基配方

酵母提取物              0.5g

示蛋白胨                0.5g

酪蛋白水解物            0.5g

葡萄糖                  0.5g

淀粉                   0.5g

磷酸氢二钾             0.3g

无水硫酸镁             0.024g

丙酮酸钠               0.3g

琼脂                   15.0g

纯化水                 1000ml

调整PH值，使得R2A琼脂灭菌后的PH值为7.2±0.2。使用高压锅，121°C下高压灭菌15分钟。

R2A琼脂促生长试验
—测试菌株的制备：使用标准菌悬液或按表0008.-1中指定的方法制备。菌株传代次数不得超过5代，并采用适当的菌种保藏技术以保证所使用菌株的生物学特性。每种菌株别按表0008.-1中所描述的方法培养。使用pH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲液或pH7.2的磷酸盐缓冲液制备测试菌悬液。制备好的菌悬液应在2小时内使用，当贮存在2-8 °C条件下，24小时内使用。也可用另外一种方法：制备并稀释新制备的枯草芽胞杆菌营养细胞的悬浮液，得到一个稳定的孢子悬液，然后使用适当体积的此胞子菌悬液进行接种测试。此稳定的胞子悬液可以在2-8 °C保存一定的时间而不失效。
—促生长试验：测试每批已制备好的培养基以及采用脱水培养基制备或按指定的成分制备的培养基。
分别将表0008.-1中指定的不超过100CFU的菌悬液（或孢子悬液）接种在R2A琼脂上，按表中指定的条件进行培养。对于新制备的细菌培养液，微生物的生长必须与先前测试过或者已经认可的培养基具有可比性。

表008.-1—R2A琼脂促生长试验

2.2.1总有机碳

本法用于检查制药用水中有机碳总量，用以间接控制水中的有机物含量。总

有机碳检查也被用于制水系统的流程控制，如监控净化和输水等单元操作的效

能。

通常采用蔗糖作为易氧化的有机物、1,4-对苯醌作为难氧化的有机物，按规

定制备各自的标准溶液，在总有机碳测定仪上分别测定相应的响应值，以考察所

采用技术的的氧化能力和仪器的系统适用性。

对仪器的一般要求 有多种方法可用于测定总有机碳。对这些技术，只要符

合下列条件均可用于水的总有机碳测定：

1、总有机碳测定技术应能区分无机碳（溶于水中的二氧化碳和碳酸氢盐分

解所产生的二氧化碳）与有机碳（有机物被氧化产生的二氧化碳），并能排除无

机碳对有机碳测定的干扰。

2、应满足系统适用性试验的要求。

3 、应具有足够的检测灵敏度（ 最低检出限为每升含碳等于或小于

0.05mg/L）。

采用经校正过的仪器对水系统进行在线监测或离线实验室测定。在线监测可

方便地对水系统进行实时测定及实时流程控制；而离线测定则有可能带来许多问

题，例如被采样、采样容器以及未受控的环境因素（如有机物的蒸汽）等污染。

由于水的生产是批量进行或连续操作的，所以在选择采用离线测定还是在线测定

时 ，应由水生产的条件和具体情况决定。

总有机碳检查用水 应采用每升含总有机碳低于0.10mg，电导率低于1.0

μS/cm（25℃）的高纯水。所用总有机碳检查用水与制备对照品溶液及系统适用

性试验溶液用水应是同一容器所盛之水。

玻璃器皿的预备  

用能除去有机物质的方法严格地清洗玻璃器皿。最后，用总有机碳检查用水润洗。

对照品溶液的制备

蔗糖对照品溶液  取经105℃干燥三小时后，加总有机碳检查用水溶解并稀释制成每升中约含1.19mg 的溶液（每升含碳0.50mg）。

1,4-对苯醌对照品溶液 取1,4-对苯醌对照品适量，精密称定，加总有机碳检查用水溶解并稀释制成每升中含0.75mg 的溶液（每升含碳0.50mg）。

供试溶液

离线测定 由于水样的采集及输送到测试装置的过程中，水样很可能遭到污染，而有机物的污染和二氧化碳的吸收都会影响测定结果的真实性。所以，测定的各个环节都应十分谨慎。采样时应使用密闭容器，采样后容器顶空应尽量小，并应及时测试。所使用的玻璃器皿必须严格清洗有机残留物，并用总有机碳检查用水做最后淋洗。

在线测定 将总有机碳在线检测装置与制水系统连接妥当。取水及测定系统都须进行充分的清洗。

系统适用性试验 取总有机碳检查用水，蔗糖对照品溶液和1,4-对苯醌对照品溶液分别进样依次记录仪器总有机碳响应值。按下式计算，以百分数表示的响应效率应为85%～115%。

100［（rss-rw）/（rs-rw）］

式中 rw —为总有机碳检查用水的空白响应值；

rs —为蔗糖对照品溶液的响应值；

rss —为1,4-对苯醌对照品溶液的响应值。

测定法 取供试制药用水适量，按仪器规定方法测定。记录仪器的响应值rU，除另有规定外，供试制药用水的响应值应不大于rs-rw  。

    此方法可同时用于预先经校正并通过系统适用性试验的在线或离线仪器操作。这种由在线或离线测定的水的质量与水样在水系统中的采集位置密切相关。

    应注意水样的采集位置必须能真实反映制药用水的质量。

2.2.2 易氧化物质

取本品100ml，加稀硝酸10ml及0.02M高锰酸钾滴定液0.1ml，煮沸5分钟，溶液仍然显粉红色。

2.3  电导率：按下列条件进行在线或离线电导率测试。
设备：电导池。
一个适当材料（如不锈钢）的电极；
电池常数：电极常数一般由供货商校正。在合适的时间间隔，使用确定的标准溶液（电导率低于1500uS.cm-1）校正或和另外一个具有校正好参数的电导率仪作比较。如果测定值和标准值的误差在2%的范围内，便可确定校正常数。否则，重新矫正。

电导率仪：准确度为0.1 μS·cm−1或更低的范围；
系统校正（电导池和电导率仪）：
一个或一个以上的已经过鉴定的参照溶液；
准确度：在被测电导率加0.1 μS·cm−1的3%以内；

电导率仪校正：测量所使用的每一个范围都应被校正，拆下电导池之后，使用被鉴定的精密电阻器，或带有一个不确定度不超过鉴定值0.1%的同等设备。如果在线电导池不能被拆下，则系统校正应根据一个已被校正过的电导率-测量设备进行，此电导率-测量设备带有一个电导池，放在将要被校正的电导池附近，在水流下进行校正。

温度测量：误差± 2 °C
操作程序：在没有温度补偿下测试电导率，同时记录测试温度。在适当的确认之后温度-补偿测量可能被执行。在所记录的温度下测得的电导率不超过表0008.-2中的值则被检测水的电导率符合要求。没有在表0008.-2中列出的温度，可以其上下相邻两点之数据用内插法计算最大允许电导率。

2.4 硝酸盐含量

取本品5ml置试管中，于冰浴中冷却，加100g/l氯化钾溶液0.4ml与0.1%二苯胺溶液0.1ml，边摇边滴加无氮的硫酸5ml，摇匀，将试管于50℃水浴中放置15分钟，溶液产生的蓝色与标准硝酸盐溶液(2 ppm NO3)0.5ml，加无硝酸盐的水4.5ml，在同一时间用同一方法处理后的颜色比较，不得更深。

2.5铝含量

供试液：取本品400ml，加10mlpH6.0的醋酸盐缓冲液及100ml蒸馏水，混合。
参照溶液：取2ml铝标准溶液(2 ppm Al)，加10mlpH6.0的醋酸盐缓冲液及98ml蒸馏水，混合。
空白溶液：取10mlpH6.0的醋酸盐缓冲液及100ml蒸馏水，混合。
将上述三种溶液按2.4.17项下描述的方法进行比较测试。

测试溶液：将20ml的供试溶液置于分液漏斗中，加入10ml的溶液（该溶液配制为：每升氯仿含有5克羟基喹啉）萃取。用氯仿将上述溶液稀释到50.0ml。

 做一个平行样。

    用上述的参照溶液，根据上述方法制备成标准溶液。

    用上述的空白溶液，根据上述方法制备成空白溶液。

    利用392nm的激光波长和滤波通道波长位于518nm处的二次过滤器或同一波长下的单色光镜，检测测试溶液（I1),标准溶液（I2)，空白溶液（I3)的荧光强度。

    测试溶液的I1-I3值不能高于标准溶液的I2-I3.

2.6 重金属

    取本品200ml，加0.1M硝酸滴定液0.15ml，置一玻璃蒸发皿中水浴加热直至体积减少至20ml，放冷后，取此溶液12ml按测试A进行。
参照溶液：取10ml标准铅溶液(1ppm Pb)，加0.1M硝酸滴定液0.075ml，按测试A进行。
空白溶液：取0.1M硝酸滴定液0.075ml，按测试A进行。

测试A:

    每个溶液中，加入PH3.5的缓冲液12ml。混匀，加入硫代乙酰胺试剂1.2ml，立刻混匀，2分钟后进行测定。如果参照溶液和空白溶液相比较，没有呈浅褐色的话，该测试无效。如果供试液的颜色不深于参照溶液，该供试液符合要求。

如果测试结果很难判定，利用膜过滤（孔径 3um，见图2.4.8-1，不需要预滤器）处理溶液。缓慢进行匀速过滤，对活塞加上适当的常压。过滤不同溶液所得的滤液，比较其斑点。

2.7细菌内毒素

本法利用鲎试剂（从鲎——Limuluspolyhemus或 Tachypleus tridentatus——血细胞提取物（amoebocyte lysate）制备而来）检测由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素或对内毒素进行定量。该检查包括三种方法：一为凝胶法，系利用鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理；第二种为浊度法（基于内源性底物断裂后，产生的浊度变化）；最后一种为显色法（得到的肽－呈色基团复合物断裂后，检测反应混合物的色度）。

这一章阐述了下面6种方法：

方法A：凝胶法：限度试验

方法B：凝胶法：半定量试验

方法C：动态浊度试验

方法D：动态显色法

方法E：终点显色法

方法F：终点浊度法

检测时，可用6种方法的任一种进行试验。当测定结果可疑或有争议时，除非另有规定，以专论中的方法A的测定结果为准。

试验操作过程应防止内毒素的污染。

仪器

所有的玻璃器皿及由其他耐热材料制成的器皿需用已验证的工艺在热烘箱内进行去热原处理。去热原时，常用的最小时间和温度设置分别为30分钟和250℃。若使用塑料器械，如微孔板和微量进样器配套的吸头等，它们必须标明无内毒素并确对试验无干扰。

注：这一章中，“管”的意思包括其他任何反应容器，如微孔板中的孔。

内毒素储备标准溶液的制备

用内毒素标准品制备内毒素储备标准溶液；所用的内毒素标准品必须先用国际标准品校准，如内毒素标准BRP。

内毒素以国际单位（IU）表示。IU的换算见国际卫生组织公布的国际标准。

注：一国际单位（IU）内毒素相当于一个内毒素单位（E.U.）。

根据包装说明书上的标准和内毒素储备标准溶液的标签上关于制备和贮存的说明。

内毒素标准溶液的制备

充分混合内毒素储备标准溶液后，用细菌内毒素试验检查用水（BET检查用水）稀释，制成适当的系列稀释液，即得BET检查用内毒素标准溶液。

得到的稀释液应尽快使用，以免因吸附而导致活性损失。

供试品溶液的制备

除非另有说明，以BET检查用水溶解或稀释活性成分或药品来制备供试品溶液。某些成分或药品可能在其它的水溶液中溶解度更高。如有必要，调节待测溶液（或它的稀释液）的pH值，使鲎试剂和供试品溶液的混合物的pH值在所选鲎试剂生产商的指定pH范围内。一般要求供试品溶液的pH值范围为6.0——8.0。可用鲎试剂生产商推荐的酸、碱或适当的缓冲溶液来调解pH值。酸或碱溶液须用BET检查用水在去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。

确定最大有效稀释倍数

最大有效稀释倍数（MVD）指可检测出内毒素限值的供试品溶液的最大稀释倍数。MVD按下列公式确定：

MVD = 内毒素限值×供试品溶液浓度/λ

内毒素限值：在剂量的基础上，注射药物的活性成分的内毒素限度为

K/M

K=人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量（EU/kg）

M＝人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量。

专论中，注射剂的活性成分的内毒素限度的单位有IU/ml、IU/mg、IU/生物活性单位等。

供试品溶液的浓度表示法：

－当内毒素限度以质量（IU/mg）表示时，用mg/ml表示浓度。

-当内毒素限度以（IU/ml）表示时，用ml/ml表示浓度。

-当内毒素限度以生物单位（IU/Unit）表示时，用Units/ml表示浓度。

λ=指凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度，或指浊度法或显色法使用的标准回归曲线上最低点（IU/ml)的对应值。

凝胶法（方法A和B）

凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或定量内毒素的方法。在标准条件下，可引起鲎试液凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度。为确保试验结果精确、有效，应根据预备试验中的说明开展试验，复核鲎试剂的标示灵敏度和试验的干扰因素。

（1） 预备试验

（i） 鲎试剂的标示灵敏度复核试验

灵敏度用IU/ml表示。应在鲎试剂用于检查内毒素之前对灵敏度进行复核；复核试验需要制备标示灵敏度λ的4支平行管。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。

用BET检查用水稀释内毒素储备标准溶液，制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四种浓度的标准溶液。

在每支试管中，分别混合等体积（通常为0.1mL)的鲎试液(lysate solution)和标准溶液。如使用的是装有鲎试剂冻干粉末的西林瓶或安瓿，可向其中直接加入溶液。按照鲎试剂生产商的建议，将反应混合物孵育一段时间(通常在37±1℃下保温60±2分钟)，在此过程中，不能振动试管。凝胶的完整性测试：如使用试管作为容器，先将试管从保温箱中取出，再缓缓将试管倒转1800。如果形成了坚实的凝胶，倒转后凝胶不移位，此时将该项检查的结果记录为阳性。如未能形成坚实且不变形的凝胶，该项检查的结果即为阴性。

仅在最低浓度的标准溶液的所有平行管的检查结果均为阴性的情况下，试验方为有效。

反应终点浓度指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。将终点浓度取对数，计算它们的平均值，再将平均值的结果取反对数，最后的表达式如下：

终点浓度的几何平均值＝lg-1(Σe/f)

Σe＝所用系列溶液的终点浓度的对数值的和

f＝平行管的数量

反应终点的浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的测量值（IU/ml）。当终点浓度的几何平均值在0.5λ至2.0λ之间时，可判定受试鲎试剂的标示灵敏度为λ，可用于内毒素的检查。

（ii） 干扰因素试验

按表2.6.14.-1制备溶液A、B、C、D。供试品的稀释度不得超过MVD，且供试品溶液不能检查出内毒素，具体操作见（1）预备试验，（i）鲎试剂标示灵敏度的复核试验项。

表2.6.14-1

A=经检查无内毒素的溶液

B=干扰实验用

C=鲎试剂标示灵敏度的对照品

D=阴性对照品（BET检查用水）

根据（1）预备试验下的（i）鲎试剂标示灵敏度的复核试验项中列出的公式，计算B和C溶液的终点浓度的几何平均值。

如试验条件发生了任何可能影响到试验结果的变化，须重新进行干扰因素试验。

只有当溶液A和D的所有平行管中无反应、且溶液C的结果在复核的鲎试剂灵敏度范围内时，试验方有效。

经测定，如果溶液B的灵敏度在[0.5λ，2.0λ]间，可判定供试品溶液在该实验条件下，对实验无干扰；反之则判定供试品溶液对试验能形成干扰。

若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。使用灵敏度更高的鲎试剂进行内毒素的检查时，因为灵敏度更高的鲎试剂能排除实验的干扰因素，供试品的稀释倍数也可适当放宽。

可通过其他适宜的方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰。为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰实验。

（2） 限度试验（方法A）

（i） 方法

按表2.6.14-2制备溶液A、B、C、D。实验方法见（1）预备试验的（i）鲎试剂标示灵敏度的复核试验项。

表2.6.14-2

制备溶液A、B（供试品阳性对照），稀释倍数不得超过MVD。按照（1）预备实验，（ii）干扰因素实验项下的说明开展实验。溶液B、C（阳性对照）所含标准内毒素的浓度为鲎试剂标示灵敏度的两倍。溶液D（阴性对照）为BET检查用水。

（ii） 结果判断

只有溶液B和C的平行管的试验结果均为阳性、溶液D的平行管的试验结果均为阴性时，试验方有效。

溶液A的平行管的试验结果均为阴性时，可判定供试品符合试验的内毒素限度要求。

如溶液的平行管的检查结果均为阳性时：

- 如供试品的稀释倍数为MVD，供试品不符合规定。

- 如供试品的稀释倍数小于MVD，应将供试品溶液稀释至较大但不超过MVD的倍数，再次开展实验。

若溶液A的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试。如复试中，溶液A的两个平行管均呈阴性，可将供试品判为符合内毒素限度要求。