层析柱是技术中的主体，一般用玻璃管或。根据样品混合物中各组分在固定相和流动相中不同，从而分离的一种法。

规格

层析柱的直径大小不影响分离度，样品用量大，可加大柱的直径，一般制备用凝胶柱，直径大于2厘米，但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上。此外， 直径加大，洗脱液体体积增大，样品稀释度大。分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱床必须有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关，但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞，一般不超过1米。分族分离时用，一般凝胶柱长20-30厘米，柱高与直径的比较5:1─10:1，凝胶床体积为样品溶液体积的4-10倍。 时柱高与直径之线为20:1─100:1，常用凝胶柱有50×25厘米，10×25厘米。层析柱滤板下的应尽可能的小，如果支掌滤板下的死体积大，被分离组分之间重新混合的可能性就大，其结果是影响洗脱峰形，出现拖尾出象，降低。在精确分离时，死体积不能超过总床体积的1/1000 [1]  。

操作方法

以中压柱层析法提取分离为例：

1.吸附剂的处理及柱子装填

将一定量装入盘置于烘箱中，于105。C活化2H后，取出放置室温即可装柱。柱子采用干法填充，填满整个柱体，不留，密封后用柱塞式计量溶剂泵按一(5：95)比例泵入溶剂，至溶剂流出止。

2.上样

将冬凌草的乙醇提取物400G用适量溶解，泵入中压柱柱头，然后泵入1000RID。

3.洗脱

以一定比例的一为，60ML/MIN的流速进行，柱的使用压力为2～ 3KG/C 。按每份500ML收集，TLC检识丙酮一氯仿(2：8)，5%乙醇液

至洗脱完全，相同流份合并，回收溶剂。将流份合并蒸干。加入适量甲醇热溶后自然放置，析出结晶，为冬凌草甲素。

4.层析柱再生、平衡

有效成分经TLC检识全部流出后，用纯5000ML再生，丙酮一(5：95)平衡后，可再次上样，反复使用(使用次数随原料不同而异，一般可连续使用2—6个月以上)。

5.重结晶

结晶析出完全后，，然后用少量甲醇洗涤(保留，作下次热溶冬凌草甲素用)。将冬凌草甲素再用适量甲醇热溶后放置，结晶再次析出，待结晶完全后，抽滤，用少量洗涤，将结晶室温下晾干后置中，35度至。密封于瓶中，置中保存。

6.薄层层析分析

取适量及由上述方法得到的冬凌草甲素样品甲醇溶解后点于同一上，以氯仿一(8：2)为进行展开，5% 香草醛乙醇液显色，于105。C烘至斑点清晰。表明在该展开系统下，冬凌草甲素样品和对照品都具有相同的，并呈现出同样的蓝绿色斑点，在制备的冬凌草甲素样品中，没有杂质斑痕。