3,4-苯并芘 ELISA盒说明书
No. 53012M
使用之前要读说明书（中文说名书仅供参考请以英文为准）！
1．概述
本产品是高灵敏度的用于定量检测3,4-苯并芘 的酶联免疫盒。适用于水样中的中3,4-苯并芘 的检测。最低检测限0.3ppb,如果有必要可以通过简单的提纯来进一步提高检测限，阳性样品可以用HPLC, GC/MS方法验证。
2. 安全性说明
试剂盒含有少量的3,4-苯并芘；物中含有四甲基联苯胺；终止液中含有稀硫酸，避免皮肤和粘膜接触终止液；以上各溶剂不小心滴到皮肤上请用水冲洗。
3. 存储和稳定性
存储：4–8℃
在使用前试剂盒中溶液的温度要恢复到室温(20-25℃)
试剂在有效期内都可以使用
4．原理
此试剂盒是通过3,4-苯并芘 抗体来检测3,4-苯并芘的。将标准品或者样品加入到微孔中和包被在微孔底部的抗3,4-苯并芘 的高亲和力抗体发生反应。如果样品中存在3,4-苯并芘 ，加入HRP（辣根过氧化物酶）标记物将竞争性的与抗体结合。加入二抗，与酶标记物结合并固定在微孔板上，洗去未结合的抗原抗体，加入显色底物，在酶的作用下显蓝色。显色颜色的深浅与样品中3,4-苯并芘 的量成反比例关系。所以，样品中的3,4-苯并芘 浓度越高，显色的蓝色将会越浅。加入酸，终止反应，底物颜色由蓝色变为棕黄色。微孔板放进酶标仪里450nm读数，样品的吸光度值与试剂盒中标准OD值相比较，相对应得出结果。
5.3,4-苯并芘 ELISA 的缺陷
在样品中出现的很多有机和无机物在检测中是不发生反应的，然而样品中那些易变性的物质产生的基质效应是不可以完全避免的。在操作中发生错误也能引起误差，比如试剂盒的存储，错误的加液顺序，试剂加入的量不准确，在免疫反应或底物反应中太长或太短的孵育时间，太高或太低的孵育温度。对于阳性样品要用液相或质谱仪做进一步的确认。
6．3,4-苯并芘 测定的重要性
苯并芘是自然和人为原因产生的一种环境污染物。苯并芘是生产过程中不完全燃烧，工业过程中有机物质的热解和在家庭活动，如烹饪，烧烤和吸烟等过程中产生的。人为来源如工业生产，运输和废物焚化等产生大量这种化合物和多环芳烃。石油生产，石油产品的进口和出口也造成了海洋污染。其他来源包括地下水和海水石油污染（如石油泄漏），烟草烟雾原油污染，尾气一切形式的化石燃料的废气和燃烧。苯并芘是脂溶性的易于在沿海海洋生物中积累并导致环境污染。
苯并芘是已知的导致了在动物模型和人体的许多器官肿瘤的一种致癌物。它已知的代谢产物之一是形成DNA聚合物并导致突变与肿瘤的发生。
由于多环芳烃致癌，致突变的性质，近年来人们提高对其检测和监测的关注度。在许多国家确定监管苯并芘含量。
7．操作数据
敏感性：3,4-苯并芘 的检测限0.3ppb，检测结果越靠近曲线的中间越准确。
重复性：. 标准的变异系数小于 10%; 样品的变异系数小于<20%.
特异性：交叉反应物质 交叉反应率
苯并芘 100%
1,2 -苯并菲 77.6%
茚并[1,2,3]芘 49.7%
苯并[b]萤蒽 20.2%
苯并[a]蒽 11.7%
芘 10.9%
萤蒽 8.6%
苯并[k]萤蒽 5.0%
标准曲线：
A．试剂盒组成
1. 真空包装微孔板 （12×8条）包被有3,4-苯并芘 多克隆抗体
2. 3,4-苯并芘 标准液：（6）0，0.25，0.75，1.5，,2.5,5.0ppb
3. 1 瓶6ml抗体溶液
3. 1 瓶6mlHRP酶标记物
4. 1 瓶25ml样品稀释液，稀释5.0ppb高浓度标准品
5. 1 瓶12 mL 底物显色液.
6. 1瓶100ml洗板缓冲液(5倍浓缩)
7. 1 瓶 6 mL 停止液.
8. 1 瓶 6 mL水样前处理试剂
B．试验准备
1． 使用前将所有的试剂拿到室温（19℃-25℃）。
2. 从铝箔袋中拿出要求数量的微孔条，放入干燥剂并重新封好袋子以免微孔条受潮。置于4-8℃保存。
3. 标准液，酶结合物，底物，终止液不用稀释直接使用。
4. 洗液在使用前要以1：5的比例稀释后使用。
5. 由于终止液中包含硫酸拿的时候要小心。
C. 操作步骤
1. 在对应的微孔中加入50 μL 标准或样品。最好做重复。
2. 使用排枪在每个孔中加入 50 μL 酶结合物。
3. 使用排枪在每个孔中加入 50 μL 抗体，轻微振荡30秒，在4-8℃中孵育60分，。
4. 倒掉微孔里液体，每个微孔至少加入250μL 1×洗液，然后弃掉洗液到合适的容器中，重复洗3次。在一层厚的吸水纸上拍板，去掉残留的洗液。
5. 每孔加入 100 μL底物显色液，在室温孵育30分。尽量使其不见光。
6. 每孔加入 50 μL终止液板中颜色将会由蓝色变为棕黄色。
7 450nm 下读取每个孔的吸光度值（OD）。
D. 结果评估
可以利用商业ELISA软件程序比如Logit/Log or 4-Parameter 来评价ELISA结果。也可以通过计算每个标准的%B/B0值，以%B/B0为y轴、3,4-苯并芘 浓度为x轴作一标准曲线。样品浓度可以通过标准曲线来计算。当样品的浓度小于标准1 (0.25ppb)时报道称浓度<0.25ppb，当浓度大于5ppb时要稀释后再测定。
半定量结果的判定，可根据样品的吸光度值与标准的吸光度值来判定，样品的吸光度值低于某个标准的吸光度值，则说明样品的3,4-苯并芘 含量大于此标准的浓度，样品的吸光度值高于某个标准的吸光度值，则说明样品的3,4-苯并芘 含量小于此标准的浓度。
